正确的抗体浓度是非常重要的,以确保最好的解决方案流式细胞术分析。太少的抗体和特定的积极信号仍然疲弱,太多的抗体和不具体的背景信号开始增加。此外,制造商的建议通常导致巨大的过剩的抗体染色协议,它通常是可能的省钱和试剂通过自己的滴定。

滴定小贴士:

1. 滴定抗体在相同条件下作为试验(温度、培养时间、体积、细胞类型和数量)
2. 重复为每个新抗体滴定后,样品制备/染色过程中的任何重大变化
3. 每个抗体分别滴定,但第二抗体(与固定浓度)可以添加需要帮助解决感兴趣的人群
4. 最小化信号噪声,包括可行性染料和Fc块,并通过闸门在单线态
5. 从5开始µg /毫升(或制造商推荐的稀释浓度是未知的;你可以打电话问公司),使至少6个1:2稀释系列+无污点的控制

寻找最优浓度:

1. 收集数据包括至少1000积极事件为每个浓度
2. 调整门分别为每个浓度稀释系列正确识别阴性和阳性
3. 测量平均荧光强度阴性和阳性并确定传播消极的人群
4. 计算分离指数(或者染色指数,使用标准偏差而不是百分位数确定传播)为每个条件和确定最优抗体浓度
• 给予最高浓度分离指数将在健壮的化验结果;小移液错误或5 x细胞总数的变化将对染色的影响很小
• 最终测定浓度可能会减少低于饱和水平如果需要减少荧光溢出在复杂多色板和阴性和阳性仍很好地分开

附加信息:

• 德福(2009)绿色光纤激光器:替代传统离散长绿激光流式细胞术。血细胞计数一次。75:1031 - 1039,doi: 10.1002 / cyto.a.20790
• Hulspas(2010)滴定fluorochrome-conjugated抗体的标记细胞表面标记活细胞。咕咕叫Protoc Cytom。54:6.29.1-6.29.9,cy0629s54 doi: 10.1002/0471142956.

图1所示。连接从一个典型的原始数据计算分离指数抗体滴定实验。5µL每反应已经饱和的几乎所有CD3抗体抗原表位和任何染色浓度的增加只会阻碍检测微弱的人群。图从血细胞计数一次。89年5月,2016 (5):427 - 9。doi: 10.1002 / cyto.a.22808

图2所示。典型的抗体滴定曲线显示周围高原最佳染色浓度。