准确的流式细胞术分析取决于使用的特异性抗体。不幸的是,大多数商用抗体缺乏验证和由最终用户确保抗体是否按预期的方式工作。近50%的人类白细胞分化抗原抗体报车间未能按计划函数!

流式细胞术的典型问题包括非特定的绑定和特定的大目标(导致假阳性)以及缺乏反应性与既定目标抗原(导致假阴性)。还要注意许多抗体用于例如西方墨点法提出针对线性抗原表位,可能不存在/暴露在活细胞而常见的流式细胞仪样品处理步骤,如酶消化和固定/透化作用可以改变本机抗原表位(或抗体和荧光团本身)。

控制验证抗体特异性:

有几种不同的控件,可以用来验证的特异性抗体。

1. 积极控制细胞
   • 已知的主要细胞表达抗原的利益(有时只有在刺激)
   • 细胞系转染表达抗原的利益(如GFP融合标签或HA确认可以给一个独立的方法表达当没有之前验证抗体可用于直接比较)
2. 负控制细胞
   • 主细胞或模拟转染细胞系已知抗原表达的兴趣
   • 靶向敲除细胞系(或从转基因动物细胞)抗原表达具体已经不存在了
3. 竞争控制
   • 多余的标记抗体用来阻止绑定标记版本的相同的抗体
   • 可溶性抗原过剩用来阻止抗体绑定到目标细胞
4. 通用的阻断剂
   • Fc块和花青染料块(特别是对单核细胞和巨噬细胞)
   • 高分子染料特定块(当使用两个或两个以上的BD地平线出色™或超级明亮的染料)
5. 二次只控制
   • 没有主要的抗体染色

附加信息:

• Hulspas(2009)的控制考虑背景荧光在临床流式细胞术。血细胞计数B76 b: 355 - 364,doi: 10.1002 / cyto.b.20485
• 布拉德伯里和Pluckthun(2015)再现性:标准化抗体用于研究。beplay苹果手机能用吗自然518年,27 - 29,doi: 10.1038 / 518027 a
• 再现性危机和抗体流式细胞术的验证,CytoU研讨会

图1所示。相同的抗体克隆(PE共轭鼠标反CD34,克隆581)从两个不同的供应商表现出明显不同的染色模式。感兴趣的细胞群与红色圈,细胞群显示不必要的绑定与橙色圈的一个产品。